厌氧沼气池中互营乙酸氧化菌群

厌氧消化是用沼气池处理有机废物/废水的重要手段,其产物甲烷也是重要的生物能源,可以补充能源供给,因此在环境污染治理以及可再生清洁能源领域具有重要地位。乙酸是厌氧沼气池消化产甲烷过程的重要中间代谢产物。在厌氧沼气池消化系统中,乙酸可以通过  乙酸分解和乙酸氧化两种途径生成甲烷21。乙  分解途径是通过乙酸营养型的产甲烷古菌直接将乙  酸分解为CH4和CO2,目前已经发现4 Methanoseato

和 Methanosarcina这两个属可以通过乙酸降解途径  产甲烷3。乙酸氧化途径是乙酸先在乙酸氧化菌  的作用下分解为CO2和H2(CHCO0-+4H2O→

2HCO3+4H2+H,AG°=+104.6kJ·mol-),然  后氢营养型产甲烷古菌利用H2和CO2产生CH  (4H2+HCO3+H→CH4+3H2O,△C"=-135

km1-)。最近的一些研究发现,互营乙酸氧化  在一些特殊环境中占有非常重要的地位,与乙酸营  养型产甲烷相比,互营乙酸氧化产甲烷更能适应环  境的胁迫(高NH2,高温,高浓度VFA等)3-9)。乙

酸氧化生成H2和CO2是吸热反应,根据热力学  原理,该反应在标准条件下不能自发进行,必须与氢  营养型产甲烷菌以氢气作为底物的产甲烷反应耦合  (CH2CO0+H2O→CH4+HCO3,△G=-31kJ

mol-)4. 10

互营乙酸氧化菌与氢营养型的产甲烷菌互营共

产生的能量需要维持这两种微生物的生命代谢活

动,其能量劣势导致互营乙酸氧化菌生长缓慢,分离

周期长,在现有培养技术条件下,对互营乙酸氧

化菌进行分离培养非常具有挑战性。到目前为止

已分离培养的互营乙酸氧化菌仅有6株,分别为1988年由Lee和 Zinder2在高温厌氧环境中得到的菌株AOR;1996年由 Schnurer分离培养的嗜中温互营乙酸氧化菌 Clostridium ultunense BS;2000年Hattori从高温甲烷发酵反应器中分离培养的hermacetogenium phaeum PB1;2002年Balk从硫酸盐还原厌氧反应器中分离培养的嗜高温乙酸氧化菌 Thermotoga lettingae TMO;2010年 Wester.holm20在中温厌氧反应器中得到的 Syntrophaceticusschenkii Sp3以及2011年 Westerholm在中温富氨厌氧反应器中分离得到 Tepidanaerobacter acetator.dans Rel 7。除菌株AOR丢失外,其它5株菌都是严格厌氧菌,它们都能与产甲烷古菌共培养,进行互营乙酸氧化产甲烷。这6株菌中只有 Clostridiumultunense Bs是中温菌,最适生长温度为37℃;其余五株菌均为嗜热菌,最适生长温度都在55℃65℃。

由于互营乙酸氧化菌的难培养性,基于分离培养的传统方法难以全面认识厌氧沼气池消化系统中的互营  乙酸氧化菌。以互营乙酸氧化途径关键功能基因为  对象,利用沼气池分子生态学方法进行互营乙酸氧化菌群

研究将是一条深入了解厌氧沼气池消化系统中互营乙酸氧  化菌群分布和多样性的有效途径

目前已知的互营乙酸氧化途径有两种,第1种是通过逆向乙酰辅酶A( acetyl-CaA)途径进行代谢,EER AOR, Thermacetogenium phaeum, Clostridium ul-unease及 Tepidanaerobacter acetatoxydans能通过该途径进行互营乙酸氧化41-2),其中,7 eidangerbacter acetatoxdans由于缺少甲酸脱氢酶,最终产物为甲酸,H2及CO2。同时,这些菌株通过正向acelvI-CoA途径能进行同型产乙酸。第2种途径是逆向 acetyl-CoA途径中羧基化过程与甘氨酸裂解过程结合的一种新途径, Thermotoga lettingae能利用该途径进行互营乙酸氧化(31。两种途径中甲酰四氢叶酸合成酶( formyltetrahydrofolate synthetaseFTHFS)均是其中的关键酶2。 Muller3)等人研究发现 Syntrophaceticus schinki也含有 FTHFS。 FTHFS能催化甲酸的活化,其编码基因 formvltetrahydrofolate synthetase gene(hs)可以用于研究同型产乙酸功能菌及互营乙酸氧化等2-2。有研究表明FTHFS在互营乙酸氧化菌中会得到更高效的表达;高温环境及产甲烷环境会抑制同型产乙酸过  小的编码。,这对解析厌氧沼气池消化产甲烧  互营乙酸氧化比较有利-2。因此,可以将F  hs用来研究沼气池产甲烷体系中互机制具有重要意义,但目前相关研究比较有限Honi2)和 robin等利用该基因在高温厌氧沼气池消化体系中发现了一些未知的互营乙酸氧化菌

笔者采集了分别来自供给原料不同、运行温度不同的湿式和干式的沼气池厌氧反应器的消化污泥,根据样品的来源特征构建3个角hs克隆文库(以乙酸为唯一碳源的中温厌氧沼气池消化体系克隆文库—C,中温厌氧消化体系克隆文库一M,高温厌氧沼气池消化体系克隆文库一H),用以研究不同厌氧反应器中互营乙酸氧化菌群的多样性和分布规律,这对解析厌氧沼气池消化产甲烷过程的微生物学过程具有重要意义

材料与方法

1样品采集及总DNA提取

研究采集了分别来自供给原料不同、运行温度不同的湿式和干式的厌氧反应器的消化污泥(见表1),采用CTAB法提取各样品总DNA

以提取的DNA为模板,利用引物 FTHFSf(5′T  TYACWGGHGAYTTCCATGO3)和 FTHFSr(5′-GTA  TTGDGTYTTRGCCATACA-3)(m进行hs基因的  PCR扩增。扩增体系为10× PCR buffer(Mg2+Pus)  5μl, dNTP mixture(各2.5mM)4μl,正向引物  FTHFSE(10mmol·L-)1ul,反向引物 FTHFSr(10  mmol·L)1μl,灭菌水36.5μl,DNA聚合酶  0.5μl,DNA模板2μl。扩增条件为94℃,5min;  94℃,40s;49℃,40s;72℃,1min;40个循环;2℃,10min。琼脂糖电泳确认PCR产物

1.3克隆文库构建  根据样品的来源特征构建3个 FTHFS基因克  隆文库:利用C1反应器PCR产物构建中温厌氧沼气池消化体系克隆文库(C);利用M~M3的PCR产物混合物构建中温厌氧消化体系克隆文库(M);利用H~H10的PCR产物混合物构建高温厌氧消化体系克隆文库(H)。

将PCR扩增得到的目标片段用 SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒(上海生工)进行纯化,纯化后的PCR产物与pMD19T载体进行连接,使用大肠杆菌DH5a感受态细胞进行转化,37℃培养约16个小时,使用T载体通用引物M1347(5′ CGC CAGGGT TTT CCC AGT CAC GAC-3), Rv-m(5'-AGCGGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA3′)对克隆子进行PCR验证。

1.4酶切分型和测序分析  使用Mpl及Aa1对阳性克隆子的PCR产物进  行酶切,根据酶切片段分布将克隆子进行分类,每类  选取1-3个代表克隆子进行测序,碱基序列相似性  大于等于97%的克隆子为同一操作分类单元  (OTU)。将碱基序列翻译为氨基酸序列,利用NCN  数据库进行相似序列比对,采用MECA4软件构  沼气池系统发育树。所获得的OTU序列提交 GenBank,编  号为KX874498至KX874527。

2沼气池结果与讨论  从C,M,H文库中分别挑取了37,54,34个阳性  克隆子,根据酶切分型结果分别选择了17,20,21个  代表克隆进行测序,将碱基序列翻译为氨基酸序列  构建了系统发育树(见图1)。表2为3个克隆文库  中OTU的系统分类情况。  C,M,H文库分别有5,11和14个OTU。3  文库克隆分布差异大,没有共有OU,M和H间只  有1个0mU(M50和H61)共有。C文库的克隆分  布在 Chloroflexi, Thermotogae及 Firmicutes这3个  门,主要集中在 Firmicutes的 hermoanaerobacterales  中,占总克隆子数量的85.71%。M文库的克隆分  布在 Bacteroidetes,Synergistetes K Firmicutes这3个  门,主要集中在 Firmicutes的 Thermoanaerobacterale  和 Clostridiales中,分别占总克隆子数量的28.57  和48.57%。H文库中约97%的克隆都分类

Firmicutes,主要集中在 Clostridiales中,占总克隆子数量的60.60%,沼气池中其它3.03%的克隆无法分类。

C文库的OTU数量明显少于M和H文库,可能是因为使用单一碳源乙酸长期培养,体系物种多样性降低。H文库的OTU数量略高于M文库,可能是因为高温环境中,互营乙酸氧化可能是乙酸分

解的主要途径3-3。3个文库中的0TU大部分都集中在 Firmicutes中,表明潜在的互营乙酸氧化菌的大部分可能分属于该门, Clostridiales和 Thermo-anaerobacterales是3个文库共有的,只在H文库中检测到有克隆分类与 Bacilli z和 Halanaerobiales。在门水平上,两个中温文库C和M具有更高的多样

性。这些结果表明温度对于乙酸互营降解菌的分布可能有一定的影响。Sun(等人通过研究不同温度

条下CSTR厌氧沼气池反应器中互营乙酸氧化也得到了相似结论。

在C文库中,OTUC65相对丰度(85.71%)最  高,与 Tepidanaerobacter syntrophicus具有100%的相  似度。 Tepidanaerobacter syntrophicus是沼气池能分解伯醇  和乳酸的严格厌氧互营细菌,分离自高温消化污泥  最适生长温度为45℃-50℃,能在25℃-60℃环境  中生存,与氢营养型的产甲烷古菌互营生长3。  OTUC12(2.86%)与已知的能利用多种氨基酸作为  碳源,生成乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等物质的 Clostridi  m sticklandii具有99%相似度。OTUc14  5.71%),OTUC13(2.86%)和OTUC51(2.86%)  均没有与之相似度较高的微生物或未培养克隆。  M文库中相对丰度最高的OTUM4(28.57%)  与 Tepidanaerobacter syntrophicus具有95%的相似  度。相对丰度第2的OTUM59(25.71%)和相对丰  度第3的OTUM68(8.57%)以及OTUM88  (2.86%)与已知的中温互营乙酸氧化菌 Clostridium  amurense t1l聚类,其相似度在80%-9%的范围内,可以认为这3个0TU代表的细菌可能是互营乙  酸氧化菌。OTUM52(2.86%)与从铀污染的含水土层中分离出来的能够氧化乳酸的 Desulfitobacteritallireducens'具有92%相似度;OTUM50与以乙酸为碳源的中温厌氧沼气池消化反应器中发现的未培养细菌N103的hs基因的其中一个拷贝具有99%相似度。oTUM101(3.03%)与油藏环境中的Synergistales bacterium在系统发育上比较接近。其余的4个0TU均没有与之相似度较高的微生物或未培养克隆。

在H文库中,相对丰度最高的OTUH20(39.39%),OTU19(3.03%)及OTUH29(3.03%

在系统发育树上单独聚类(包括M23),总量占H文  库的45.45%,这些OTU无相似微生物或克隆,可能  是高温条件下主要的乙酸氧化菌。OrUH3  (9.09%)与已知的互营乙酸氧化菌 Clostridium ul  unease具有90%的相似性。OTUH61(6.06%)和  OTUH4(3.03%)分别与未培养细菌N013)的  基因的两个不同拷贝具有9%和93%的相似性。  OUH08(6.06%)与一个未知细菌克隆具有99  的相似性。其余的7个OTU均没有与之相似度较  高的微生物或未培养克隆。  由以上分析可以看出,所获得OTU中,只有  OTUM88和已知的互营乙酸氧化菌具有很高的相  似性(99%)。尽管已知的互营乙酸氧化菌大部分  为高温菌,但在H文库中没有发现和已知高温互营  乙酸氧化菌相似的Om。可以认为,厌氧沼气池消化系统  中存在大量未知的互营乙酸氧化菌。由于C文库  是以乙酸为唯一碳源的厌氧系统的文库,在以乙酸  为唯碳源的厌氧系统中,乙酸分解占主要地位同  型乙酸合成则可以不考虑,因此C文库中获得的  OTU都是可能的互营乙酸氧化菌。  少数几个OTU和已知微生物间具有相对较高  的相似性,如和 Tepidanaerobacter syntrophicus  Clostridium sticklandii具有较高相似性的oC  OTUM4OTUC12,它们均来源于C文库。7可m  aerobacter syntrophic属于 Thermoanaerobacterial  目。Nain(等发现在中国大港油田中Them  anaerobacteriales是参与互营乙酸氧化产甲烷的主要  细菌类群:Rdm则等发现的和 Thermaceto  kivu具有较高相似性的潜在乙酸氧化菌也属

Thermoanaerobacteriales目;已知的乙酸氧化菌中,Tepidanaerobacter ncetatoxydans K Thermacetogeniumphaeum也属于 Thermoanaerobacteriales目。可以推测, Thermoanaerobacteriales可能在许多环境条件下都是参与互营乙酸氧化产甲烷的主要细菌类群。笔者研究中检测到的其它分属于该目的OTUM4,MI2,M19,H2,H10则都是可能的互营乙酸氧化菌。3结论

笔者研究采集了分别来自供给原料不同、运行温度不同的湿式和干式的厌氧反应器的消化污泥,根据样品的来源特征构建3个hs克隆文库,研究了乙酸氧化菌群的多样性和分布情况。结果表明,在厌氧消化沼气池系统中存在大量未知的互营乙酸氧化菌,且多样性高,运行温度对互营乙酸氧化菌群具有定影响。今后需要结合宏组学等手段对这些可能的  互营乙酸氧化菌群进行深入研究,揭示它们的遗传  和代谢特征,以及它们在厌氧沼气池消化环境中分布规律  和对环境因子的相应特征,为厌氧沼气池消化系统的调控和稳定运行提供基础。

摘自《中国沼气》2018第1期 作者 易悦 董劼 王慧中 郑丹 苟敏 汤岳琴