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沼气池厌氧消化污泥体系的研究
时间 : 2019-11-09 浏览量 : 1

山东达禹环境工程有限公司已在沼气工程领域深耕十年,有着丰富的行业经验,生产各种沼气设备,承接大中小各种规模的沼气工程,承建黑膜沼气池红泥膜沼气池等各种软体沼气池双膜气柜、集雨窑等,同时生产加工各类液袋水囊、桥梁预压水袋、森林消防水袋、可拆卸游泳池等,欢迎新老客户洽谈合作,共谋发展!

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摘自《中国沼气》第6期 赵宇莎 郑丹 于琪 苟敬 汤岳琴


沼气工程沼气池厌氧消化能有效地促进能源与环境的协调发  展,一直备受关注。该过程通常需要不同微生物群  落(发酵细菌,产氢产乙酸菌和产甲烷菌)的参与协  作,才能实现甲烷的生产。研究证实,有更多功  能与特性未知的未培养微生物参与了沼气工程沼气池厌氧消化过  程,产甲烷机制比预期的更加复杂2。因此,鉴定  沼气工程沼气池厌氧消化体系中的微生物多样性,有助于深入理解  产甲烷机制并指导工艺优化调控。宏基因组学是近  20年新兴的科学领域,它避开微生物的分离培养过


程,直接从基因层面原位研究微生物的多样性,可最大限度地识别环境微生物的群落信息。基于宏基因组的分子生物学技术(如DGGE,16sRNA基因克隆文库,T-RFLP等)的发展,已经成为分析沼气工程沼气池厌氧消化过程优势微生物的重要平台。但这些传统方法鉴定到的优势菌群往往并非是“真正”的功能微生物。

DNA稳定同位素探针( DNA stable- Isotope pro-bing,DNA-SP)是一种新兴的分子生态学技术,可


用于甄别复杂环境中参与特殊代谢功能的微生物。  其基本原理为:环境样品经稳定同位素标记的底物  (以C为主)培养后,微生物利用“C底物生长繁殖  合成"CDNA,通过浮力密度差异将”CDNA与”C  DNA分离,进一步对CDNA进行分析即可获得功  能微生物的信息。由于 DNA-SIP仅以来源于底物  利用菌的CDNA为研究对象,因此极大地降低了  环境微生物群落的复杂性,从而将底物代谢过程与  微生物群落组成直接相联系3。鉴于 DNA-SIH技  术的优势,现已被应用于不同环境中各类微生物功  能菌的鉴定(如甲基互营,生物降解,碳氮循环等过  程),但其在沼气工程沼气池厌氧消化过程中的应用相对较少6  此外, DNA-SIP存在CDNA回收量小、时间

长、容易交叉标记等缺陷,因此,探索合适的标记及  离心条件并获得足够的CDNA是成功富集功能微

生物的关键。本研究以”C葡萄糖为底物,考察

了不同条件对沼气工程沼气池厌氧消化污泥中葡萄糖利用菌的标记  效果旨在为鉴定真正的沼气工程沼气池厌氧消化功能群提供基础,

进而促进对沼气工程沼气池厌氧产甲烷机制的理解。

材料与方法

1.I污泥来源

用于稳定同位素标记的污泥来自本实验的纤维

素沼气工程沼气池厌氧消化反应器。该完全混合型反应器总体积3L

工作体积2L,纤维素进料负荷为1gLd-1,在53℃

低速搅拌(85mm)条件下连续稳定运行212d。

1.2试剂

主要试剂如”C葡萄糖(C,99%),CsCl,CTAB购于 sIgma公司(美国)

1.3污泥样品的标记及分析

1.3.1标记样品的培养及采样

取30mL沼气工程沼气池厌氧消化污泥于50mL沼气工程沼气池厌氧瓶中,通

氮气置换空气后,立即采用丁基胶塞和铝盖密封并放置于摇床中饿养至污泥停止产气。随后将葡萄糖溶于灭菌水后采用无菌注射器投入沼气工程沼气池厌氧瓶,同时补充少量微量元素溶液,于53℃和150mpm条件下培养并取样分析。底物添加及取样操作均在沼气工程沼气池厌氧手套箱( Gene Science AG30,美国)中进行。所有处理均设置两个平行样,并分别以C葡萄糖作为对照。其中,使用的微量元素溶液组分如下(gL)FeCl3·6H2O,1.35;MnCl2·4H2O,0.1;CaC2·2H,0,0.1;ZnC2,0.1;CuO2H20,0.025;H3BO3,0  01;Na2MO4·2H20,0.024;NaCl,1.O;Na2SeO3·5


H2O,0.026;次氮基三乙酸(NTA),12.8  1.3.2标记过程的气体和样品收集

定期采用10mL无菌注射器测定产气量  品样定期取样后,于12000pm,4℃离心10min后

污泥沉淀和适量体积PBS缓冲溶液混合震荡,于

12000m,4℃离心10min,反复清洗2-3次后,去除上清液,污泥沉淀保存于-80℃,用于后续的PCR1.3.3超高速密度梯度离心分离

利用常规CTAB法提取污泥的总DNA。取

Hg DNA,与4.8 mL CsCl溶液,1.2 mL Grader

er(GB缓冲液)混匀,采用10m无菌注射器将混合液移至6ml超高速离心管中,于超高速离心机( Beckman Coulter, OptimaI.80XP,美国)离心形成浮力密度梯度区带。离心后使用软管连接精密注射泵( Harvard Apparatus Pump Il Pico Plus,美国)与离心管,利用无菌水的水压收集各层样品,并采用折光仪( Reichert AR200,美国)测定各层级折光率。折光率与密度的换算公式如下:

n=0.07969+1.2649

式中:n为液体折光率;p为液体密度,gmL

1.3.4荧光定量PCR分析

对各层样品的16 SrNA基因含量(拷贝数)进行荧光定量PCR分析。反应体系总体积为20μl包括:10uM引物Eu518F及Eu27F各0.8ul,SYBR染液10山1,DNA2.0,灭菌水6.4ul。PCR反应  条件如下:95℃,预变性308;95℃,变性10s,50℃退火5s,72℃,延伸40s,共40个循环;融解95℃10s,65℃60s,97℃1s;冷却37℃30s。以16sTDNA基因的丰度(每层拷贝数与各层级拷贝数总和的比值)为纵坐标,浮力密度为横坐标,可得16mDNA基因在不同浮力密度中的分布规律图。

1.4DNA-SP标记条件的优化

1.4.1离心转速对DNA-SIP标记效果的影响

取底物投加量为30mg葡萄糖,标记时间为4天的样品,分别在45400mpm和50300mm的转速下于20℃离心40h,考察超高速离心转速对标记效果的影响

1.4.2底物投加量对 DNA-SIP标记效果的影响

分别投加总量为30mg和60mg的葡萄糖,考察底物投机量对标记效果的影响。30mg葡萄糖次性投加,停止产气时(4d)取样。60mg葡萄糖于  第0和6天分别投加30mg,取样时间为第11天


143若平消它每DP标定效果的响

10mn。利用上清液稀释使得污泥固含量分别为  a1%,0.2%,0.4%,2.1%(w/w)。分批投加总量  为100mg的葡萄糖进行标记培养,即于第0,4和8  天分别投加333mg,取样时间为第8和12天(取  样时底物投加总量分别为660m和100mg)。样  品经20℃,45400m,40h超离速离心分层后,考察  污泥固含量对标记效果的影响。

结果

离心条件优化

实验室前期小试发现:经C葡萄糖标记的污泥中的CDNA与CDNA的浮力密度分别为1.70

及1.72-1.74gmL左右(数据未显示)。因此,本研究考察了文献报道常用的两个离心转速(50300mm和45400mpm)对污泥样品的 DNA-SIP  标记效果。表1显示:不同转速下形成的CC介质  中相邻梯度区带的浮力密度差有较大差异。由表1  可知转速为45400mpm形成的浮力密度差较小。为  确保两种DNA离心后相隔一个区带,能被有效分  离,故后续离心条件设为20℃,45400mpm,40h  表1不同转速条件下微生物DNA的分离效果(gmL


2.2底物投加量优化

分别向污泥中投加总量为30mg和60mg的葡萄糖,产气量如图1所示。由图可知:所有样品的产气量均在第1天迅速升高,微生物每消耗完30mg葡萄糖大约需4~6d,随后逐渐停止产气。且C


葡萄糖与C葡萄糖的产气趋势及产气量基本吻合,可作为对照进行后续实验。同时,根据产气结果,将30mg和60mg葡萄糖标记样品的取样时间分别设置为第4天和第11天。


标记后的污泥样品经超高速离心分层以后,利  用定量PCR检测每层的16 S rDNA基因含量。获得  16 S rDNA基因丰度在不同浮力密度中的分布规律,  如图3和图4所示。由图可知,在轻密度层1.69~  1.71gmL的范围内,所有样品均出现最高丰度,  这表明污泥样品CDNA在1.70gm-左右的密度  层被富集。在重密度层1.72~1.74gmL的范围  内,投加有30mgC-葡萄糖的污泥样品仅检测到  较低的16 S rdNA基因拷贝数,表明该条件下C  DNA富集程度不高。投加有60mg"C-葡萄糖的样  品CDNA丰度明显提高,两个平行样品的丰度分  别达到了10.41%和6.05%,而C葡萄糖对照样品  中的丰度仅为1.0%,这表明60mg的C-葡萄糖可  以富集到更多的CDNA,功能菌能被有效标记。  但图3和图4也显示,在1.72~1.74g·mL前后的  密度层中也能检测到一定数量的CDNA。因此,为了  为提高重密度层中CDNA的丰度,减少非目标微生


2.3污泥固含量优化

污泥固含量对 DNA-SIP标记效果的影响如图5~  图8所示。由图可知:在1.72-1.74gmL的密度范  围内,污泥固含量为0.1%,0.2%和0.4%(w/w)的所  有样品的CDNA拷贝数明显高于2.1%的样品。  当底物投加量为66.6mg时(标记8天的样  品),C-DNA主要存在于1.72gmL左右的密度层,且不同污泥固含量样品的"CDNA丰度差异较大。污泥固含量为0.1%,0.2%,0.4%和2.1%(w/w)的样品中,C-DNA丰度分别约为16.3%10%,10%和8.2%。这表示在该底物浓度下污泥固含量越低,C-DNA富集程度越高。而在更“重”的密度层1.74g·mL附近,各污泥固含量的CDNA丰度均低于5%。

当底物投加量为100mg时(标记12d的样品),与第8天的标记样品相比,所有污泥样品在72-1.74g·mL密度层的CDNA丰度均有明显提升。尤其在1.74g·mL的密度层,除污泥固含量为2.1%的样品外,其它样品的CDNA丰度均从第8天的低于5%提升至15%左右。上述结果


表明:当底物投加量从66.6mg增至100mg时,可  有效提高CDNA在重密度层的丰度,显示出更好  的标记效果。此外2.1%固含量的污泥样品中的CDNA拷贝数在1.72-1.74gmL密度层仍然最低,表明即使投加更高浓度的底物,相对较低的污泥固含量仍更有利于CDNA的富集。但在污泥固含量为0.4%,0.2%,0.1%的样品中,CDNA在1.74gmL密度层的丰度并未随着污泥固含量的减少而增大(分别为16.3%,14.2%和14%)。这可能是底物投加量已超过污泥中微生物的代谢水


平,大部分功能微生物已被标记,若继续增加底物投  加量难以提高样品的标记效果。

讨论

DNA-SIH具有鉴定不同环境中“真正”功能微  物的优势。合适的标记及离心条件可以避免底物  二级利用,确保DNA的标记及富集效果,是决定  该技术成功的关键。但标记效果受到多因素的影  响:如环境样品性质、微生物种类、底物结构、标记时  间离心转速及时间等, DNA-SIP的培养条件及离心  条件难以标准化。鉴于利用 DNA-SIP识别沼气工程沼气池厌氧  消化功能微生物的研究相对较少,本研究考察了不  同条件(离心转速、底物投加量和污泥固含量)对厌  氧污泥中葡萄糖利用菌的标记效果的影响。  利用超高速密度梯度离心技术可有效地将环境  总DNA中的CDNA与CDNA有效分离。本研  究发现45400mm的转速比50300mpm有更好的CDNA富集效果。据报道,DNA在CaC1介质中的浮力密度与微生物的GC含量成正比”。但无论哪种转速条件,重浮力密度层仍然同时含有2CDNA与CDNA。 Lueders8等发现,即使采用纯菌的CDNA进行超高速离心,重密度层中仍能检测到0.7%的CDNA。因此,这说明目标微生物很难00%被标记, DNA-SIF实验必须设计C底物的对照样品。

研究表明,当 C-DNA丰度接近20%时,更容  易从环境样品总DNA中分离出"CDNA。而C  DNA的生成伴随着微生物细胞对底物的同化利用,  这表明CDNA丰度与底物投加量和微生物种群数  量(本文为污泥固含量)存在直接联系。底物投加  量优化结果显示:在1.2-1.74g·mL-的密度范


围内,投加30mg1C-葡萄糖的污泥样品的C.DNA

丰度较低。目前尚无标准方法来确定底物投加量

但底物浓度过低难以标记到目标微生物,因为仅有

1/3的底物被微生物用于合成自身物质。此外,加入体系的底物被微生物同化之前会有一个稀释过

程,这使得微生物会暂时利用其他碳源或中间代谢产物,这一特性降低了C-DNA的比例,进一步增加了计算底物投加量的难度°。虽然分批投加60mgC-葡萄糖可以将C-DNA丰度提高到10.41%,但仍含有较多的非目标微生物。因此,在后续考察污泥固含量的研究中,将"C-葡萄糖投加量提高到了100mg,此时污泥中C-DNA丰度最高可达16.3%。上述结果表明,高的底物投加量有助于提高CDNA丰度。但底物投加量过高,一方面会增加DNA-SIP的成本;另一方面会使样品脱离原始状态群落代谢过程受到影响,产生微生物富集偏差,不符合 DNA-SIP原位鉴定的宗旨。因此,在满足CDNA的标记效果及分离效果的基础上,采用最少的C底物是理想的培养实验。污泥固含量研究结果显示:当底物浓度一定时(不高于污泥最高代谢水平),污泥固含量越低,C-DNA富集程度越高。该结果进一步证实底物量与微生物种群数量需要有合适的比例,才能获得最高的标记CDNA。不同研究报道中的微生物菌群生态位、生理代谢差异极大,因此,非常有必要对这两个因素进行优化

4结论

选择合适的标记及离心条件以获得足够的C  DNA,是利用 DNA-SIR技术成功富集功能微生物的关键。本研究以C葡萄糖为底物,选取离心转速,底物投加量和污泥固含量3个重要因素,考察了它  们对沼气工程沼气池厌氧消化污泥中葡萄糖利用菌的 DNA-SIP标记效果的影响。结果显示,相对低的转速、高底物投  加量及低污泥固含量可以获得较高的CDNA丰  度。但底物量不能一味增加,需同时考虑微生物的  代谢水平、与环境条件的一致性等因素,在尽量减少


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