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新型沼气池厂家研究微生物群落和沼气产量的影响
时间 : 2019-09-25 浏览量 : 4

山东达禹环境工程有限公司已在沼气工程领域深耕十年,有着丰富的行业经验,生产各种沼气设备,承接大中小各种规模的沼气工程,承建黑膜沼气池红泥膜沼气池等各种软体沼气池双膜气柜、集雨窑等,同时生产加工各类液袋水囊、桥梁预压水袋、森林消防水袋、可拆卸游泳池等,欢迎新老客户洽谈合作,共谋发展!


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我国作为农业大国秸秆资源量丰富,但利用率较低造成了资源浪费和环境污染,利用秸秆生产沼


气是提高秸秆利用率和缓解环境污染的有效途径之  。新型沼气池沼气发酵是在多种微生物共同作用下完成的,


温度,浓度,接种物,CN3,pH值和搅  拌“以及物料成分配比等对厌氧发酵有重要影  响。氮素是影响新型沼气池沼气发酵重要的营养元素之一,秸秆的碳氮比极高,这意味着以秸秆为原料的新型沼气池沼气发  酵体系中氮素对于发酵过程的影响可能更大,优化发酵条件有利于微生物迅速繁殖,从而提高反应器性能和新型沼气池沼气产量。

根据秸秆的分子式计算秸秆完全液化能够提供厌氧发酵微生物所需的氮),但秸秆在实际发酵过程中很难全部被利用,且分解时间较长,微生物所需的氮含量不能在发酵各个阶段满足微生物的需求,尤其是在发酵初始阶段,影响了新型沼气池沼气工程的发酵效率和最终产量。余少杰等通过添加不同浓度的氯化铵来研究外加氮源对秸秆厌氧发酵的影响,研究结果0显示适量浓度的氮添加可以促进厌氧发酵体系中纤维素等物料的水解,而高浓度的氮素添加会抑制纤维素水解和甲烷生成。 Pia tek等通过模型分析发现氮含量是影响水解和甲烷生成过程动力学的关键因素。 Wagner等研究了添加不同种类的氮源在厌氧发酵过程中对甲烷产量的影响,发现  氮源中碳含量会影响甲烷的产率,在适宜的浓度范  围内才能获得较高的甲烷产量。虽然原料中碳素转  化为CH4和CO2是碳素间的循环,但在厌氧发酵  中,微生物是将秸秆中的碳素转化为CH4的功能执  行者。 Wagner等从多样性指数上分析了不同氮  源对微生物多样性的影响,但未对功能菌株的丰度


变化进行阐述。 Alsouleman'14-15等研究发现,高氨  氮胁迫下厌氧反应体系发生适应性变化,主导菌群  从拟杆菌转变为梭菌。随着宏基因组测序技术的快  速发展,应用宏基因组技术来研究样本中直接参与  碳和氮循环的功能微生物类群的总量和多样性是近年来环境微生物的研究热点之一,但对添加氮素后微生物群落多样性以及功能基因的变化以及如何影响发酵体系和甲烷产量的研究鲜有报道。因此,研究氮素添加对新型沼气池沼气发酵过程中微生物群落和关键功能基因的影响具有重要意义。

本研究解析玉米秸秆新型沼气池沼气发酵过程中添加氮素对料液中微生物多样性的影响,探究产甲烷关键功能基因丰度的变化,通过计算纤维素等物料的降解情况并结合产气量与产气周期,从微生物和功能基因的角度揭示氮素添加与秸秆新型沼气池沼气产量之间的关系,解析发酵过程中不同阶段细菌、古菌的多样性与  功能特征,注释功能菌株的丰度的变化,进一步探究


新型沼气池沼气发酵中关键因子的作用,为提高玉米秸秆新型沼气池沼气发酵产气效率提供数据支撑。

1材料与方法

1、1试验原料

试验用玉米秸秆取自黑龙江八一农垦大学实验实习基地,在10月份收获籽粒后,秸秆风干粉碎备用,接种污泥源于本实验室运行良好的厌氧发酵反应器,主要性质见表1,其中玉米风干秸秆的纤维素、半纤维素和木质素含量分别为30.52%,27.77%和10.99%。


1.2间歇式秸秆新型沼气池沼气发酵体系建立

试验装置选用25L自制厌氧发酵反应器,上设有出气口和进料口,下设有出料口。出气口与15L集气袋相连,用于收集气体并测定体积(见图1)。甲烷含量通过GA2000便携式新型沼气池沼气分析仪( GeotechBiogas Check)测定。发酵体积为20L,接种污泥12L,总TS设定为8%,启动时秸秆一次性进料,不足蒸馏水补齐。

根据前期单因素试验结果,选取添加有机氮尿素1gL作为处理,不加氮为对照,设置3个重复,控制发酵温度为35℃,反应时间60d。随着发酵的  进行,每10d进行1次投料,物料添加量为总秸秆添加的1/6


1.3试验方法

1.3.116 SrrNA测序


在前期连续进料的新型沼气池沼气发酵试验中,对照和处

理分别在发酵的第1.10,40天和60天进行取样,每

个样品平行取3次,混合均匀后加入缓冲液( Extrac

tion Buffer)-20℃保藏。利用改进的氯化苄法提取  样品总DNA。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测,使

用 Nanodrop200e(Them)检测DNA的纯度和浓

度。将合格的样品总DNA送至四川博贝特生物科

技有限公司进行高通量测序。PCR扩增引物对应

区域:细菌16V4区引物515F(5′ GTGCCAGO

MGCCGCGGTAA3)和909R(5′ CCCCGYCAATTC  MTTTRAGT3)。古菌引物344F(5′ ACGGGGYG

CAGCAGGCGCGA3)和806R(5′ GGACTACH

VGGGTWTCTAAT-3)

1.3.2统计分析

研究采用 oniginpro2017软件对试验数据进行处理和分析。

1.3.3宏基因组学分析

在第一次产气高峰第10天进行取样,处理与对照样品平行取3次,混合均匀后加入缓冲液( Extraction Buffer),将样品送至上海派森诺公司进行DNA提取和宏基因组测序。

1.3.3.1物种注释

将每个样本的 Scaffolds/ Scanties序列与NCBlNT数据库中的细菌、古菌、真菌和病毒序列进行  BLASTN相似性比对(E值设定为<0.001)。由于每一条目标序列可能匹配多条参考序列,而这些匹配的参考序列又分属不同的分类单元,为使分析严谨可靠,同时又不丢失生物学意义,我们在 MEGAN软件中采取“最低共同祖先( Lowest Common Ancesor,LCA)”算法),将参考序列分化为不同物种分枝前的最后一级共同分类,作为目标序列的物种分类注释信息。结合 Scaffolds/ Scaftigs序列在各样本中的丰度数据,获得各样本在所需分类等级上的相对丰度分布表

1.3.3.2功能注释

基因的功能注释是将非冗余蛋白序列集同常用的蛋白数据库进行比对,从而对各样本中的基因功能进行注释分析。KEGG注释是指通过将蛋白序列和KEGG代谢通路数据库进行比对,对宏基因组预测得到的基因根据代谢通路进行注释和分类。我们将上述非冗余蛋白序列集上传至KAS( KEGG AutomaticAnnotation Server)进行功能注释,并对返回的  g  注释结果进行汇总统计,获取各等级的注释结果及


对应的丰度信息。

2结果与分析

2.1添加氮素对间歇式秸杆新型沼气池沼气发酵产气量的影响

在发酵的前28d,处理的日产气量稳定且高于对照(见图2),在第10天达到第1个产气高峰,为17750mLd-。处理和对照均在第25天达到产气高峰,分别为15077mLd-和11707mL·d-。从第28天到第41天,对照恢复其产气潜力,日产气量高于处理,发挥产气优势。发酵前30d进料对产气量的变化并不明显,从第40天开始,处理和对照在产气量上无显著性差异,产气趋势相似。产气量在每次进料后均上升,之后开始下降,到下一次进料产气量又出现了显著提升。测定发酵结束后纤维素和半纤维素降解率,处理达到33%和44%,显著高于对照的6%和28%。


日产甲烷量变化趋势与日产气量的变化趋势相似,笔者对发酵进行不同天数后的累积甲烷产量进行统计分析(见图3),发酵前10d,20d,30d处理的甲烷累积产量分别是64943mL,137048mL,199459mL,显著高于对照的14110mL,50343mL,123720mL。发酵前40d,处理的甲烷累积产量仍高于对照。发酵结束后,处理的甲烷总产量为308200mL,仍然高于对照的284728mL。处理在第10天达到第1个产甲烷高峰,为10880mL·d-1。对照在第20天达到一个峰值,为6103mL·d-1。处理和对照均在第23天达到日产甲烷产量的最高峰,分别为1388mL·d-和8164mL·d。从第26天到第41天,对照日产甲烷量高于处理。从第41天到发酵结束,处理和对照的甲烷产量无显著差异。


发酵料液中提取的7个样品总DNA条带清晰,杂质较少,无严重拖尾现象。 Nanodrop检测出的DNA浓度在197.8~380.9ng·L之间,OD260/280在1.90~2.07之间,均符合送样要求(浓度>10ng·L-;OD260/280在1.8-2.2之间)。对7个样品中的细菌和古菌的16 SrRNA V4区序列进行高通量测序。对比 Shannon指数可以看出(见表2),古菌的 Shannon指数均低于细菌,说明细菌的微生物多样性要高于古菌的多样性。比较处理和对照中的细菌 Alpha多样性指数,发酵第10天处理高于对照,随着发酵的进行,对照 Shannon指数增加,说明其多样性有所增加,而处理的 Shannon指数和simpson指数均呈下降趋势,微生物多样性下降。从古菌的 Alpha多样性指数变化规律可以看出,处理中古菌多样性的变化规律同处理中细菌变化一致。


2.2.2发酵料液中细菌和古菌群落组成分析  将细菌的各菌群丰度占比1%以上的25类菌  属作图(见图4),从属的分类水平进行分析,发酵原  料中 Clostridium占比最高。对照中,普氏菌属(Pre  wdla)、拟杆菌属( Bacteroides)、瘤胃球菌属(Rumi  m)和 Sphaerochaeta占比较高。处理中Ramnofilibacter,螺旋体属( Treponema)和 Sphaerocho占比较高。比较发酵各时期对照和处理均表现出不同的细菌菌群组成,二者优势菌群各不相同,菌群多样性存在差异。比较对照和处理发现, Sphaerochaea菌属在发酵的各时期均存在。

古菌的各菌群丰度在属的分类水平上分析(见图5),在整个发酵过程中,甲烷鬃毛菌属( Methano-ea)(36.7%~68.7%)一直占据最高比例。对照中占比较高的菌群包括 Methanosaeta(45.8%5.1%), Methanoculleus(5.6%~16.2%)。处理中占比较高的菌群包括 Methanosaeta(36.7%~68.7%),


Methanoculleus(7.2%-14.2%)和甲烷螺旋菌属Methanospirillum)(6.6%-85%)

在发酵第10天时,对照中 Methanosaeta的丰度为57.1%,处理为36.7%,优势菌群 Methanosaeta的数量随氮浓度的增加而减少。随着发酵的进行,处理中的 Methanosaeta丰度逐渐增加,但对照中却


在中期开始减少。说明 Methanosaeta在氮素充足的环境中缺少竞争力,丰度下降。只有在环境中营养成分缺少的情况下 Methanosaeta的竞争力才开始显现,成为环境中的优势菌属。 Methanoculleus的丰度也受氮素的影响,其丰度随着氮浓度的升高而增加,Methanoculleus能在氮素充足的环境中快速成为优势菌属,随着发酵的持续和氮素的消耗,对照中Methanoculleus的丰度要高于处理。说明 Methaoculeus可以充分利用秸秆分解后的营养物质成为环境中优势菌属,在环境中有较强的竞争力和适应能力。在发酵初期,氮素处理产气显著高于对照,可以看出在玉米秸秆厌氧发酵过程中, Methanoculleus对产气的贡献更大。随着发酵的进行,对照产气量持续提升,较处理产气率高,其中的甲烷杆菌属( Methanobacterium)丰度逐渐提升,对产气提升做出了较大贡献。


2.3玉米秸秆新型沼气池沼气发酵体系宏基因组学研究  2.3.1物种丰度差异分析

前期16 SrRNA gene测序分析已经证明在发酵  10d处理和对照在丰度上存在差异,利用宏基因组  数据可以进一步分析每个样本在各分类学水平的组  成丰度分布,逐一比较每个分类单元在两个样本之间的丰度差异,并通过统计检验评价差异是否显著。  处理与对照在门水平上有27个门具有显著差异,属  水平上有475个属具有显著差异,在种水平上有777个种具有显著差异(见表3)。物种丰度的变化直接影响新型沼气池沼气发酵体系群落的功能性,尤其是功能


菌种丰度的显著变化,通过以上数据可知,氮素添加  能够显著影响发酵体系中微生物的丰度。

2.3.2功能基因差异分析

在功能基因水平上,我们分析了能量代谢中各功能基因的丰度(见图6),发现氮素处理中甲烷代谢( methane metabolism)的丰度高于处理,而氧化磷酸化等有关能量代谢的基因的丰度变化不明显。甲烷代谢基因是产甲烷的关键基因,氮素添加提升了甲烷代谢基因的丰度。


讨论

Wagner"等研究了多种氮源添加对产气高峰期的影响,与本研究的氮素添加后产气高峰提前且一段时间产气量显著提升的研究结果一致,但没有对多周期发酵进行测定。我们在研究氮素添加的半连续发酵结果显示,处理在中后期产气能力低于对照。氮素添加虽然促进了纤维素的水解,为古菌的代谢提供了营养底物。但随发酵进行,处理中其它微生物所需的元素和营养底物被大量消耗,后期虽然氮素含量和对照持平,但根据元素守恒定律,其它必需元素含量会低于对照。而对照初期由于氮素含量和其他营养物质含量低,细菌代谢和纤维素水解受到限制,随着发酵的进行,纤维素水解产物等营养物质含量增加,细菌和古菌多样性逐渐提高,产气潜力开始显现。但整个发酵过程中处理的纤维素等物料的水解率显著高于对照,提供了更多的营养物质,处理的总甲烷产量仍高于对照。

在发酵起始阶段 Clostridium丰度占比较高,这与 Weimer1)等发现 Clostridium能够将纤维素和半纤维素等大分子水解成葡萄糖的结果一致。甲烷八


更球菌属( Methanosarcina)等产甲烷古菌的丰度提  升可能和产酸菌群一样受氮素含量和底物浓度影  响。产气高峰期 Methanosarcina丰度增加,对产甲  具有较大贡献,这与 Bharathi等的研究结论一  hmm在处理和对照中丰度一直占据优  致。  ,Cam2)等发现 Methanosaeta有较强的产甲烷能  力结论与本研究结果相似。发酵体系中还注释到  Sphaerochaeta,AbtB(21等曾在白蚁的肠道中分离出  该均属。 Ritalaht(2等曾在红杉河底层沉积物中分  离出 Sphaerochaeta globosa,发现其能利用多种底物  进行发酵产甲酸盐和乙酸盐。但在新型沼气池沼气发酵体系  中,鲜有关于 zerochaeta的报道,其在玉米秸秆降  解产甲烷环境中可能具有重要作用。  张彩杰2等在研究了C/N对细菌群落的影响时发现碳氮比降低,细菌多样性提升,优势菌群丰度增高,这与本研究发现细菌的变化规律相同。本研究还分析了在产甲烷阶段具有重要作用的古菌群落多样性,发现古菌的群落多样性变化和细菌相似对于食氢产甲烷菌和食乙酸产甲烷菌来说,丰富的

养底物可以被利用进行代谢,此时,产甲烷功能基因的丰度要比环境中微生物的多样性更为重要Lin(21等发现功能基因的多样性提升不利于代谢途径的有序性,并且可能带来更多的功能冗余,在探究有关能量代谢的基因丰度变化时发现,甲烷代谢相关基因丰度的增加和新型沼气池沼气产量呈正相关,与Qiang23等研究温度对新型沼气池沼气发酵体系影响的结果致。虽然本研究没有探究功能基因的多样性与产气量的关系,但处理中的甲烷代谢功能基因表达显得更为集中。这说明氮素的添加和温度一样对甲烷代谢的功能基因具有调节作用。


本研究发现处理中古菌的多样性虽然提升了,  但甲烷代谢的功能基因的丰度并没有降低,说明微  生物多样性提升和功能基因的集中表达不存在矛  盾。 Shade20等认为微生物的多样性只是环境微生  物中一个单纯的指标,我们同样认为多样性的高低  不能直接说明一定的问题,复杂的代谢过程需要多  种功能微生物共同参与,又或者环境中微生物多样性低,而重要的功能微生物丰度又占据绝对优势,或许这正是我们想要的,但自然环境往往不是这样的,这同样需要在具体的环境中分析。

4结论

(1)以玉米秸秆为原料的厌氧新型沼气池沼气发酵过程


中,利用16 SrRNA gene和宏基因组测序技术分析发现,氮素添加能够提升厌氧发酵过程中细菌的多样性和丰度,细菌多样性的变化特别是具备纤维素降解功能菌株丰度的提升能够加速纤维素、半纤维素等物质的水解和代谢过程。氮素添加和纤维素等物质的加速分解有效的提升了反应器内古菌代谢所需  的营养底物,提升了古菌的多样性和丰度,促进了产甲烷古菌的代谢和甲烷代谢基因丰度的提升。  (2)氮素添加通过提升微生物的丰度以及产甲  烷功能基因的丰度,缩短了达到产气高峰所需的周  期,并在一段时间内维持稳定的产气量和甲烷含量,  最终在整个发酵周期内显著提升新型沼气池沼气产气量和TS甲烷产率。



摘自《中国沼气》第5期 赵一全 马茹霞 李家威 晏磊 罗涛 梅自力 王伟东

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