云南红豆杉( Taxus yunnanensis Cheng et La)又名西南红豆杉,是云南省级珍贵树种,也是云南省一级重点保护树种,是中国生产紫杉醇药物的主要树种-3。研究发现,云南红豆杉根、皮、枝叶中含治癌药物成分紫杉醇等多种治癌药物成分,含量达0.02%。具有防治癌症、白血病等特殊疗效。但目前由交链孢霉属造成的云南红豆杉叶片叶斑病现象日趋普遍,影响了树势生长及药用、观赏价值。

红泥膜沼气池沼液是有机物在进行厌氧消化产生沼气的同时  而得到的一种厌氧产物,含有丰富的营养物质,矿物  质、水解酶、B族维生素、氨基酸、植物激素、抗生素

和腐殖酸等6,是一种良好的有机液体肥料,同时又有杀灭或抑制植物病原菌的作用。

相关研究显示,不同发酵原料产生的红泥膜沼气池沼液对交链孢菌有不同的抑制效果,其中青蒿红泥膜沼气池沼液的抑制效果最好7。目前对红泥膜沼气池沼液抑制各种病原菌方面的研究较多8-1,但对于在红泥膜沼气池沼液中添加活性成分对云南红豆杉叶斑病病原菌方面的类似研究较少,但是由于在发酵红泥膜沼气池沼液中检测到了腐殖酸,赤霉素,VB1,VB2,VB6及NH4等活性物质,为了探究是哪种活性物质对抑制交链孢菌起主导作用,并且哪种浓度的活性物质对红泥膜沼气池沼液抑制交链孢菌的效果影响最为显

著,因此,本实验采用青蒿原红泥膜沼气池沼液做空白,并在红泥膜沼气池沼液  中添加不同浓度的腐殖酸,赤霉素,VB1,VB2,VB6  及(NH4)2SO4,旨在能获得增强红泥膜沼气池沼液抑制植物病原菌的有效方法。

1实验材料与方法

1.1实验材料

1.1.1供试病原菌  实验所用交链孢菌由云南农业大学植物病理重  点实验室(该室分离提纯并鉴定的菌株)提供。

1.1.2培养基  实验室采用常规的PDA培养基4。采用马铃  薯为培养基,配方为:马铃薯200g(去皮切成1cm  左右的正方体小块后煮30min,过滤取清液用),葡萄  糖25g,琼脂20g,加水至1000mL,不调节pH值

1.1.3药品

葡萄糖,琼脂粉,腐殖酸,赤霉素,VB1,VB2,VB。及(NH4)2SO4

1.1.4仪器

实验所用主要仪器为:电磁炉、烧杯、玻璃棒、纱  布、试管、培养皿、恒温培养箱、高温灭菌锅、无菌打孔器、镊子、接种环和SWCJ-1F洁净工作台(14-15

1.1.5供试红泥膜沼气池沼液  取用学校周边青蒿( Artemisia annua)为发酵原料经过正常发酵后的红泥膜沼气池沼液。

.2方法

1.2.1红泥膜沼气池沼液的处理方法  将不同来源的红泥膜沼气池沼液经12000pm离心1min后  取上清液0.5mL加入已准备好的培养基表面,涂布  均匀后做实验组,对照组则加入0.5mL无菌蒸馏水  14-15

1.2.2活性成分处理方法

(1)依次向以青蒿作为发酵原料的红泥膜沼气池沼液内部添加腐殖酸调节浓度依次为1%,2%,3%,4%,5%,6%。

(2)依次向以青蒿作为发酵原料的红泥膜沼气池沼液内部添加赤霉素,并调节其浓度为0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%。

(3)依次向以青蒿作为发酵原料的红泥膜沼气池沼液内部添加VB1,并调节其浓度为0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%。

(4)依次向以青蒿作为发酵原料的红泥膜沼气池沼液内部添加VB2,并调节其浓度为0.1%,0.2%,0.3%

0.4%,0.5%,0.6%。  (5)依次向以青蒿作为发酵原料  加VB,并调节其浓度为0.1%0的  0.4%,0.5%,0.6%。  (6)依次向以青蒿作为发酵原料的沿  加(NH4)2SO4,调节浓度依次为1%,2%,3%  5%,6%。

1.2.3数据处理方法

抑制菌丝生长率计算采用生长速率法  抑制数(cm)=对照平板培养基上菌落直

抑菌率(%)=  处理平板培养基上菌落

对照菌落净生长量一处理菌落净生长盛  对照菌落净生长量

1.2.4试验方法

(1)将供试菌种接种于PDA平板培养基上至长满整个平板,放置备用

(2)不同浓度活性成分的添加:分别向青液中添加腐殖酸,赤霉素,VB1,VB2,1(NH4)2SO4。浓度梯度如下:

含腐殖酸的浓度依次为1%,2%,3%5%,6%;含赤霉素的浓度依次是0.1%03%0.4%,0.5%,0.6%:含(NHL)0  依次是1%,2%,3%,4%,5%,6%;含VB、  VB的浓度依次是0.1%,0.2%,0.3%.049  0.6%。加入预先备有培养基的(q=9m)平  布均匀,2个平行,备用,对照组用无菌蒸馏水

(3)抑菌试验:把调配好的红泥膜沼气池沼液和青蒿原沿液  分别采用打孔粘贴法进行抑制交链孢菌的实验,取  布满供试交链孢菌的PDA培养基平板,用无菌打孔  器(q=9mm)取出菌落边缘生长旺盛的菌丝,用子小心地将菌种块移入不同抑菌液处理的平板上菌丝一面朝上,每个培养皿中放入3小块菌种,并呈三角形放于平板中央,加盖并标记,放于25℃恒温培养箱中培养,定时观察测量不用培养基平板上交链孢霉菌的直径1。

(4)待培养24h以后,用十字交叉法测量菌块生长的大小。之后每天同一时间再对菌块进行一次测量,一共测量4d的数据14-15。

2结果与分析

2.1不同浓度腐殖酸对红泥膜沼气池沼液抑菌效果的影响  向以青蒿为发酵原料经过正常发酵后的红泥膜沼气池沼液里

边添加不同浓度的腐殖酸,复配后对交链孢菌抑菌效果的对比结果如图1所示。

由图1可以看出,在添加的腐殖酸浓度为1%  2%时,复配液对交链孢菌的抑菌效果弱于青蒿原  红泥膜沼气池沼液,而当添加的腐殖酸浓度大于2%时,其复配液  的抑菌活性强于青蒿原红泥膜沼气池沼液。当添加的腐殖酸浓度  介于3%-6%时,随着病原菌培养时间的增长,青蒿原红泥膜沼气池沼液与复配液之间的抑菌强度差距减小,且当病原菌生长到第4天时,抑菌率都达到了70%。由于腐殖酸对病原菌游动孢子的萌发的抑制效果随浓  度的增加而更显著,所以得出:高浓度的腐殖酸  对病原菌起到抑制生长的作用,低浓度的腐殖酸反而抑菌效果较差。  2.2不同浓度的赤霉素对红泥膜沼气池沼液抑菌效果的影响  向以青蒿为发酵原料经过正常发酵后的红泥膜沼气池沼液里  边添加不同浓度的赤霉素,复配后对交链孢菌抑菌

果的对比结果如图2所示。

由图2可以看出,当添加的赤霉素浓度在0.1%~0.3%时,复配液对交链孢菌的抑制作用弱于青蒿原红泥膜沼气池沼液,但当添加赤霉素的浓度在0.4%

0.6%时,复配液的抑菌作用强于青蒿原红泥膜沼气池沼液,随着添加赤霉素浓度的不断加大,抑菌效果与原红泥膜沼气池沼液相当。因为赤霉素具有促进细胞分裂和伸长的作用,较低浓度时则表现出刺激病原菌,但浓度较高时则会使细胞死亡。所以可得:高浓度的赤霉素能加强原红泥膜沼气池沼液的抑菌效果,反之低浓度的赤霉素则削弱原红泥膜沼气池沼液的抑菌效果。

2.3不同浓度的VB1对红泥膜沼气池沼液抑菌效果的影响  向以青蒿为发酵原料经过正常发酵后的红泥膜沼气池沼液里  边添加不同浓度的VB1,复配后对交链孢菌抑菌效果的对比结果如图3所示。

由图3可看出,当添加的VB1的浓度为0.1%时,复配液的抑菌效果强于青蒿原红泥膜沼气池沼液,但是随着添加的VB1浓度的增大,对交链孢菌的抑制作用逐渐减弱。VB1对细胞具有刺激生长的作用,但存在刺激生长的最适浓度0.1%,所以随着添加浓度的不断增大至超过最适浓度,复配液对病原菌的抑制作用不断减弱。由此可以得出:低浓度的VB1对原红泥膜沼气池沼液的抑菌效果有加强的作用,而高浓度的VB1则会削弱青蒿原红泥膜沼气池沼液对交链孢菌的抑制效果。

2.4不同浓度的VB2对红泥膜沼气池沼液抑菌效果的影响

向以青蒿为发酵原料经过正常发酵后的红泥膜沼气池沼液里边添加不同浓度的VB2,复配后对交链孢菌抑菌效果的对比结果如图4所示。

由图4可以看出,在添加VB2的浓度在0.1%  ~0.3%时,复配液的抑菌效果显著;但当添加的  VB2大于0.3%时,随着VB2浓度的增加,其复配液  的抑菌效果趋于平稳。因为ⅤB2对细胞生长代谢  起促进作用,但存在促进的最适浓度0.2%,所以在  添加浓度不断增大至超过了最适浓度时,对原红泥膜沼气池沼液  的抑菌效果影响越来越不显著。由以上得出:VB2

能够有效地增加青蒿原红泥膜沼气池沼液的抑菌效果。

2.5不同浓度的VB6对红泥膜沼气池沼液抑菌效果的影响

向以青蒿为发酵原料经过正常发酵后的红泥膜沼气池沼液里边添加不同浓度的VB6,复配后对交链孢菌抑菌效果的对比结果如图5所示。

由图5可以看出,当添加VB6的浓度在0.3%时,复配液对交链孢菌的抑制效果强于青蒿原红泥膜沼气池沼液;当添加的ⅤB浓度增加到0.4%时,复配液的抑制作用弱于青蒿原红泥膜沼气池沼液。VB。在细胞蛋白质的合成和分解代谢中起到促进作用,添加低浓度时促进作用较强,导致原红泥膜沼气池沼液的抑菌效果加强,随着添加浓度的增大,促进作用减弱导致原红泥膜沼气池沼液的抑制效果不显著。由此得出:低浓度的VB6可以增强原红泥膜沼气池沼液的抑菌效果,反之则降低了原红泥膜沼气池沼液的抑菌效果。

2.6不同浓度的(NH4)2SO4对红泥膜沼气池沼液抑菌效果的影

响  向以青蒿为发酵原料经过正常发酵后的红泥膜沼气池沼液里边添加不同浓度的NH4,复配后对交链孢菌抑菌效果的对比结果如图6所示。  由图6可以看出,向青蒿原红泥膜沼气池沼液里添加NH4对

红泥膜沼气池沼液抑制交链孢菌的生长有显著的影响,出  对病原菌孢子的萌发起抑制作用,所以,  同浓度的NH4的复配液的抑菌效果都  红泥膜沼气池沼液。随着病原菌培养时间的增加,M,F  红泥膜沼气池沼液抑制交链孢菌的影响逐渐减弱,但始终  增强原红泥膜沼气池沼液抑菌的效果。

综上可知,在红泥膜沼气池沼液里添加不同浓度的腐随  霉素,VB1,VB2,VB6及(NH4)2SO4都对青德原  抑制交链孢菌有不同程度的影响。各活性成适浓度依次是:3%,0.4%,0.1%,0.4%,01%。但是低浓度的vB。对原红泥膜沼气池沼液的抑菌效果影响,高浓度的VB6反而削弱了原红泥膜沼气池沼液的抑用。总的来说,青蒿红泥膜沼气池沼液中添加合适浓度的活分对抑制交链孢菌具有较好的效果。

3结论

当红泥膜沼气池沼液中添加的腐殖酸浓度为1%-2%时  复配液对交链孢菌的抑制效果弱于青嵩原红泥膜沼气池沼液  添加腐殖酸的浓度介于3%~6%时,复配液对  孢菌的抑制作用强于青蒿原红泥膜沼气池沼液,并且随着病原  培养时间的增强,青蒿原红泥膜沼气池沼液与复配液之间的  效果相当,因此,红泥膜沼气池沼液添加腐殖酸的最适浓度为3%。

当红泥膜沼气池沼液中添加的赤霉素浓度为0.1%-03时,其复配液对交链孢菌的抑制效果弱于青蒿原液,但是,添加赤霉素浓度介于0.4%~0.6%时,复配液对交链孢菌的抑制作用强于青蒿原红泥膜沼气池沼液,但着添加的赤霉素浓度的不断增加,青蒿红泥膜沼气池沼液与复液之间的抑菌效果相当,因此,红泥膜沼气池沼液添加赤霉素的量佳浓度为4%。  当红泥膜沼气池沼液中添加的VB1浓度为0.1%时,其复

液对交链孢菌的抑制效果强于青蒿原沿液,但随着41  添加的VB1浓度的增加,复配液的抑菌效果有所减  弱,因此,红泥膜沼气池沼液添加VB1的最适浓度为0.%。  当红泥膜沼气池沼液中添加的VB2浓度为0.1%-0.3%时,  其复配液对交链孢菌的抑制效果随着添加的(3  的浓度的增加而增强,但添加的VB2的浓度为  0.3%-0.6%时,其复配液的抑菌效果与青蒿原沼(6  液的几乎相同,因此,红泥膜沼气池沼液里添加VB2的最适浓度  为0.3%。  当红泥膜沼气池沼液中添加的VB浓度小于0.3%时,其复  配液对交链孢菌的抑制效果几乎与青蒿原红泥膜沼气池沼液相(8  当但添加VB6的浓度大于0.4%时,其复配液的抑  菌效果又低于原红泥膜沼气池沼液,因此,低浓度的VB6对青蒿  原红泥膜沼气池沼液的抑菌效果几乎无影响,但高浓度的VB反而会削弱原红泥膜沼气池沼液的抑菌效果。

当青蒿红泥膜沼气池沼液中添加不同浓度的NH,其复配液对交链孢菌的抑制效果都比青蒿原红泥膜沼气池沼液要强,但是随着病原菌培养时间的增长,其NH对青蒿原沼  液的影响逐渐减弱,但始终增强了青蒿原红泥膜沼气池沼液的抑菌效果。  有相关研究表明:猪粪红泥膜沼气池沼液中的NH4对辣椒  疫霉菌的抑制效果,其结果表明NH4不仅可抑制  疫霉属病原真菌游动孢子的释放,还可抑制其萌发,  进而降低土壤中病原菌的数量,且腐殖酸是畜禽粪  便红泥膜沼气池沼液中有机碳的主要成分,不仅可以作为调节剂  改善土壤结构,提高土壤肥力,还可以作为生物催化  剂和生物刺激剂促进植物生长,提高植物抵御病、虫  害能力。另外也有研究表的(1,腐殖酸能刺激土壤  中有益微生物的生长和繁殖。所以,在红泥膜沼气池沼液里添加  适宜浓度的活性成分对病原菌的抑制效果有有效影

摘自《中国沼气》第4期 刘继红 尹芳 王昌梅 赵兴玲  吴凯 柳静 杨红 刘士清 张无敌

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